IPTG (ísóprópýl-β-D-þíógalaktósíð) er hliðstæða β-galaktósídasa hvarfefnis, sem er mjög örvandi. Við örvun IPTG getur örvinn myndað fléttu við bælipróteinið, þannig að lögun bælipróteinsins breytist, þannig að það getur ekki sameinast markgeninu og markgenið er tjáð á skilvirkan hátt. Hvernig ætti þá að ákvarða styrk IPTG í tilrauninni? Er það stærra, því betra?
Fyrst skulum við skilja meginregluna á bak við IPTG örvun: Laktósaóperón (þáttur) E. coli inniheldur þrjú byggingargen, Z, Y og A, sem kóða fyrir β-galaktósídasa, permeasa og asetýltransferasa, talið í sömu röð. lacZ vatnsrofnar laktósa í glúkósa og galaktósa, eða í allólaktósa; lacY leyfir laktósa úr umhverfinu að fara í gegnum frumuhimnuna og inn í frumuna; lacA flytur asetýlhópinn frá asetýl-CoA yfir í β-galaktósíð, sem felur í sér að fjarlægja eituráhrif. Að auki er til staðar virkniröð O, upphafsröð P og stjórngen I. I-genakóðinn er bæliefni sem getur bundist við stöðu O í virkjaröðinni, þannig að óperónið (meta) er bælt og slökkt á. Það er einnig bindingarstaður fyrir niðurbrotsgenavirkjunarprótein - CAP bindingarstaður fyrir ofan upphafsröðina P. P-röðin, O-röðin og CAP bindingarstaðurinn mynda saman stjórnunarsvæðið fyrir lac-óperónið. Erfðagen ensímanna þriggja eru stjórnað af sama stjórnunarsvæði til að ná fram samhæfðri tjáningu genaafurða.
Í fjarveru laktósa er lac-óperónið (meta) í bælingarástandi. Á þessum tímapunkti binst lac-bæliefnið, sem I-röðin tjáir undir stjórn PI-hvataraðarinnar, við O-röðina, sem kemur í veg fyrir að RNA-pólýmerasi bindist P-röðinni og hamlar upphafi umritunar; þegar laktósi er til staðar er hægt að örva lac-óperónið (meta). Í þessu óperónakerfi (meta) er raunverulegi örvinn ekki laktósinn sjálfur. Laktósi fer inn í frumuna og er hvataður af β-galaktósídasa til að breytast í allólaktósa. Sá síðarnefndi, sem örvunarsameind, binst bæliefninu og breytir próteinbyggingu, sem leiðir til að bæliefninu klofnar frá O-röðinni og umritun. Ísóprópýlþíógalaktósíð (IPTG) hefur sömu áhrif og allólaktósi. Það er mjög öflugur örvi sem umbrotnar ekki af bakteríum og er mjög stöðugur, þannig að hann er mikið notaður á rannsóknarstofum.
Hvernig á að ákvarða kjörþéttni IPTG? Tökum E. coli sem dæmi.
Erfðabreytta E. coli BL21 stofninn sem innihélt jákvæða endurmyndaða pGEX (CGRP/msCT) var sáð í LB fljótandi miðil sem innihélt 50μg·mL-1 Amp og ræktaður yfir nótt við 37°C. Ofangreind ræktun var sáð í 10 flöskur af 50 ml af ferskum LB fljótandi miðli sem innihélt 50μg·mL-1 Amp í hlutfallinu 1:100 fyrir útvíkkunarræktun, og þegar OD600 gildið var 0,6~0,8 var IPTG bætt við lokastyrkinn. Það er 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmól·L-1. Eftir örvun við sama hitastig og á sama tíma var 1 ml af bakteríulausninni tekinn úr henni og bakteríufrumurnar safnaðar með skilvindu og látnar gangast undir SDS-PAGE til að greina áhrif mismunandi IPTG-styrkleika á prótíntjáningu og síðan velja IPTG-styrkinn með mestu prótíntjáninguna.
Eftir tilraunir kom í ljós að styrkur IPTG er ekki eins mikill og mögulegt er. Þetta er vegna þess að IPTG hefur ákveðna eituráhrif á bakteríur. Að fara yfir styrkinn drepur einnig frumurnar; og almennt séð vonumst við til þess að því meira leysanlegt prótein sem er tjáð í frumunni, því betra, en í mörgum tilfellum þegar styrkur IPTG er of hár myndast mikið magn af innfelldu próteini. Líkaminn, en magn leysanlegs próteins minnkar. Þess vegna er hentugasta IPTG-styrkurinn oft ekki því meiri því betra, heldur því lægri.
Tilgangur örvunar og ræktunar erfðabreyttra stofna er að auka uppskeru markpróteinsins og lækka kostnað. Tjáning markgensins er ekki aðeins undir áhrifum stofnsins sjálfs og tjáningarplasmíðsins, heldur einnig annarra ytri aðstæðna, svo sem styrk örvans, örvunarhitastigs og örvunartíma. Þess vegna er almennt best að rannsaka örvunartíma, hitastig og IPTG-styrk áður en óþekkt prótein er tjáð og hreinsað til að velja viðeigandi aðstæður og fá bestu tilraunaniðurstöður.
Birtingartími: 31. des. 2021